Técnica de Edición Genómica en Diabetes Gestacional

Transformación de células progenitoras de hígado en células Beta

Tanto el hígado como el páncreas surgen de las células endodérmicas del intestino anterior embrionario y comparten un origen común. El hígado de los adultos alberga a las "células ovales", que se activan en ciertos tipos de lesiones, especialmente en condiciones de proliferación de hepatocitos dañados, por ejemplo cuando los roedores son alimentados con una dieta 3,5-dietoxicarbon  y 1,4-dihidrocollidina (DDC). Las células ovales son bipotenciales, que se pueden diferenciar en epitelio biliar como hepatocitos. Además, se ha demostrado que las células ovales pueden producir insulina.

Se demostró que la transferencia de Pdx1 mediada por adenovirus provoca la expresión de insulina en el hígado de ratones diabéticos inducidos por STZ. La expresión hepática de Pdx1 condujo a la aparición de células que expresan insulina y enzimas acinares pancreáticas como tripsina.  En conclusión, este factor de transcripción produce células exocrinas y endocrinas pancreáticas en el hígado de ratones diabéticos adultos, a través de las células ovales. 

Referencia: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780128005637000087

Disección de mecanismos de diabetes/ enfermedad metabólica utilizando células madre pluripotentes.

La diabetes y los síndromes metabólicos son enfermedades crónicas devastadoras con una prevalencia creciente. Aunque los pacientes desarrollan diabetes debido a mutaciones monogénicas, la mayoría se deben a complejas interacciones genético-ambientales.

Las células madre pluripotentes humanas están siendo usadas para el modelado de estas enfermedades in vitro. Con los recientes avances rápidos en las herramientas de edición genómica, estas células ahora pueden manipularse genéticamente con relativa facilidad

En este artículo se destaca la diabetes, los genes metabólicos y las variantes genéticas que podrían estudiarse utilizando estas dos potentes tecnologías que tienen el poder de dilucidar la fisiopatología subyacente que se origina a partir de defectos en

1) Desarrollo de células beta, metabolismo o supervivencia o 

2) Desarrollo de adipocitos

Con estos avances en la derivación de células maduras y funcionales de tipo pancreático beta humano de hPSCs in vitro se espera que el modelado de la enfermedad progrese potencialmente.

Referencias: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4563028/

Conversión de células α pancreáticas adultas a células β después de la pérdida extrema de células β

Las células β productoras de insulina pancreática tienen una vida útil prolongada, de modo que en condiciones saludables se replican poco durante toda la vida. No obstante, muestran una auto duplicación aumentada después del aumento de la demanda metabólica o después de una lesión (es decir, pérdida de células β).

Se presenta la regeneración de células Beta en un modelo transgénico de ablación selectiva aguda de células B casi total inducida por toxina diftérica. Al administrar insulina, los ratones sobrevivieron y mostraron un aumento de la masa de células B con el tiempo.
El trazado de linaje para etiquetar las Células alfa productoras de glucagón antes de la ablación de células B rastreo grandes fracciones de células B regeneradas como derivadas de células alfa revelando un grado previamente desatendido de plasticidad de las células pancreáticas. Dicha convención de célula adulta endocrina espontanea podría aprovecharse para métodos de producción de células B para terapias de diabetes, ya sea en entornos de diferenciación in vitro o en regeneración inducida.

Ventajas de los Animales Transgénicos

- Investigación de medicamentos, vacunas, antes de que éstas sean utilizadas en humanos.
- Animales estudiados con fines terapéuticos
- Supone riesgos secundarios en la salud de los pacientes.- Simulación de enfermedades y el seguimiento de éstas.

- Xenotransplantes. 

Desventajas de los Animales Transgénicos 

- Problemas éticos y morales ya que los animales se consideran igual que a los seres humanos en cuestiones de sufrimiento.

-Se han relacionado con problemas de fertilidad.

-En reacciones inmunológicas anormales, los genes introducidos en los cultivos pueden dar origen a proteínas o enzimas que al ser ingeridas, induzcan alergias.

Referencia: https://www.nature.com/articles/nature08894

ADN Recombinante en Diabetes Gestacional

La tecnología recombinante del ADN ha permitido disponer de análogos de insulina humana para el tratamiento de DG, cuya eficacia y seguridad han permitido mejorar el tratamiento de esta enfermedad.

En la naturaleza:

La ingeniería genética ha permitido tratar a pacientes con diabetes mediante la utilización de ADN recombinante, este mecanismo permite que la insulina humana pueda producirse en otros organismo y así poder ser utilizados en los distintos tratamientos.

Proinsulina: prohormona precursora de insulina, sintetizada por células beta de los islotes pancreáticos. en humanos, es codificada por el gen INS. Esta es procesada hasta insulina humana mediante métodos enzimáticos utilizando microorganismos.

Artificial:

Glulisina: se obtiene por tecnologia de ADN recombinante, en Escherichia Coli. Es una versión de la insulina de acción corta, actúa reemplazando la insulina que se produce en el cuerpo, ayudando a pasar el azúcar de la sangre a otros tejidos del cuerpo, donde se usa para obtener energia. Tambien evita que el higado produzca más azúcar.

Insulina Lispro: se logró con la inversión de 2 aminoácidos prolina y lisina, en las posiciones 28 y 29 de la cadena B de la molécula de insulina humana, produce menos tasa de hipoglicemias.

Insulina aspártica: análogo de insulina de acción rápida, se logró con la sustitución de la prosición 28 de la cadena B de la insulina por ácido aspártivo, esta sustitución disminuye la tendencia de la molécula de insulina a formar hexános.

 

Referencias: http://sci-hub.tw/https://doi.org/10.1016/j.semerg.2012.04.010
http://www.ejournal.unam.mx/cns/no34/CNS03408.pdf
https://revista.cnic.edu.cu/revistaCB/articulos/expresi%C3%B3n-y-purificaci%C3%B3n-de-proinsulina-humana-partir-de-cultivos-de-ra%C3%ADces-transformadas

Western blot en Diabetes Gestacional

Tema: Receptor de detección de calcio en embarazos complicados por Diabetes Mellitus Gestacional

Los bebes nacidos de madres con Diabetes Gestacional experimentan varias complicaciones, incluida la hipocalcemia posnatal. En este estudio se investiga la asociación entre el receptor sensor de calcio (CaSR) y la hipocalcemia neonatal observada en embarazos con DMG.

Métodos: la expresión placentaria de CaSR se evaluó con inmunihistoquímica y Western Blot. Se evaluaron tres polimorfismos de un solo nucleótido CaSR, A986S, R990G, Q1011E, en el ADN genómico del neonato. El suero de Ca, P, Mg, 25 (OH) D Y PTH se midieron en sangre del cordón y en el segundo día de vida.

Western Blot: los tejidos placentarios se homogeneizaron en un tampón de lisis con un contenido de b- mercaptoetanol como reactivo reductor. El Gránulo de proteína se disolvió en urea 8M y se sometió a centrifugación. Las muestras se cargaron en un gel de SDS-PAGE al 8%. Membrana de nitrocelulosa Protan se utilizó para la transferencia de proteínas y CaSR se detectó utilizando un anticuerpo específico.

Conclusiones: CaSR está sub-expresado en DMG en comparación con placentas saludables. El CaSR placentario ejerce un efecto local en la homeostasis del Ca del feto, que se disocia de su contribución a la regulación de la homeostasis del Ca en la vida posnatal.

Referencias: https://www.placentajournal.org/article/S0143-4004(14)00193-3/pdf 

Articulo de PCR 

Tema: Búsqueda de la asociación de los polimorfismo rs1884614 y rs2144908 del gen HNF4-alfa con la diabetes gestacional.

Objetivo: Búsqueda de la asociación de los polimorfismos rs1884614 y rs2144908 en el promotor 2 del gen HNF4-alfa con la DG.

Muestra Biológica: raspado de carrillo bucal  del lado izquierdo y derecho de la boca con un cepillo (citobrush).

Tipo de ácidos nucléicos: ADN Genómico.

Gen a amplificar:  variantes rs188614 y rs2144908 del promotor 2 del gen HNF4-alfa.

Tipo de PCR: PCR Simple.

Las condiciones de la PCR para la variante rs1884614 fueron de 94 ºC 5´, 94 ºC 30", 66 ºC 15" y 72 ºC 30" y para la variante rs2144908 fue de 94 ºC 5´, 94 ºC 30", 64 ºC 15" y 72 ºC 30.
Los cebadores utilizados  fueron: 5´CTGAGGCTCAGAGCAGGGTG3´ y 5´TTGGCCTGAGGGGAC TCTCT3´ para la variante rs1884614 y 5´TTATGTCATCATTGCTGAGG3´ y 5´GCAGAGGCTGAAACC A3´para la variante rs2144908 ubicadas en el promotor 2 del gen HNF4-alfa.

Visualización:
Los productos de PCR fueron visualizados por electroforesis en un gel de agarosa, posteriormente los fragmentos fueron purificados y secuenciados con un secuenciador automático AVANT.

Referencia: http://www.medigraphic.com/pdfs/sanmil/sm-2012/sm123c.pdf 

Prueba de tamizaje y una confirmatoria para diabetes gestacional.

El test de O`Sullivan se realiza entre las 20 y las 24 semanas en pacientes con factores de riesgo para la diabetes gestacional y entre las 24 y las 28 semanas en la población general, por ser el mejor momento para poder detectar la DG. No tiene ningún tipo de riesgo.

Propone un enfoque a dos pasos y consiste en la determinación de la glucemia basal una hora después de la administración de 50 gr de glucosa por vía oral; a cualquier hora del día e independientemente de la ingesta o no de alimentos previa. Si el valor al cabo de una hora es igual o superior a 140 mg/dl (7,8 mmol/L), se considera el test de O`Sullivan positivo y se deberá realizar una sobrecarga oral a la glucosa (SOG) para confirmar el diagnóstico de diabetes gestacional, los valores mayores de 180 mg/dl a la hora, son diagnósticos de diabetes gestacional. La sensibilidad del test de O`Sullivan es del 80%.

Sobrecarga oral de Glucosa

Si el test de O' Sullivan es positivo, se deberá realizar una sobrecarga oral de glucosa para confirmar el diagnóstico de Diabetes Gestacional. También en aquellas gestantes que tengan una glucemia en ayunas entre 85 y 125 mg/dl.

Se administran 100 gramos de glucosa vía oral, midiendo los niveles de glucosa en sangre al inicio, a la hora, a las 2 horas y a las 3 horas de la administración. Los valores de normalidad son los siguientes: 105 mg/dl al inicio, 190 mg/dl a la hora, 165 mg/dl a las 2 horas, 145 mg/dl a las 3 horas. Se considera diagnóstica de diabetes gestacional si dos o más valores son iguales o superiores a lo normal. Si sólo un valor excede los límites sería diagnosticada de intolerancia a la glucosa en el embarazo y debe repetirse la prueba en tres o cuatro semanas.

Referencias: 

http://ri.uaemex.mx/handle/20.500.11799/13967

https://www.webconsultas.com/embarazo/complicaciones-del-embarazo/diagnostico-de-la-diabetes-gestacional

https://www.salud.mapfre.es/laboratorio/prueba-sobrecarga-oral-glucosa/

https://www.niddk.nih.gov/health-information/informacion-de-la-salud/diabetes/informacion-general/pruebas-diagnostico 

Alteración de la epigenómica en la diabetes gestacional.

Las alteraciones epigenomicas son un potencial mecanismo para la mala programación metabólica fetal. La exposición intrauterina a un medio hipoglucémico incrementa el riesgo y programación en la descendencia para desarrollar diabetes y/u obesidad en la vida adulta. La programación fetal ocasionada por un entorno diabético se denomina memoria metabólica, esta implica adaptaciones realizadas durante la vida intrauterina para asegurar la adaptación en la vida postal.

La mala nutrición durante la gestación puede causar defectos persistentes en el producto como reducción de número de células de los tejidos, la modificación estructural de órganos, la selección de ciertos clones de células y la modificación en el ajuste de ejes hormonales clave.

Así por ejemplo la disminución en el aporte de donadores de grupo metilo durante el embarazo como folatos metionina, colina y complejo B se asocian con la metilación del ADN del recién nacido.

Referencias:

http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1851-30342014000300005
http://www.medigraphic.com/pdfs/actpedmex/apm-2012/apm121e.pdf
http://www.medigraphic.com/pdfs/imss/im-2014/ims141o.pdf

ALTERACIONES DE LA TRADUCCIÓN EN DIABETES GESTACIONAL

La genética consiste en como el ADN de los genes se transcribe a ARN mensajero (ARNm) que después es traducido a proteínas, así como también de otras formas de este ácido nucleico como el ARN ribosómico o el ARN de transferencia, que catalizan y controlan la expresión de genes dentro de las células. 

Los microRNA se utilizan como biomarcadores para predecir Diabetes Gestacional en etapas tempranas del embarazo.

Son una clase de ARN pequeños no codificantes que funcional como represores traduccionales implicados en muchos procesos biológicos importantes, específicamente, se requieren microRNA para el desarrollo pancreático y la regulación de la secreción de insulina estimulada por glucosa, por lo cual la falla traduccional se involucra en  la patogénesis de la Diabetes Gestacional. 

 Referencias Bibliográficas: 

https://www.amc.edu.mx/revistaciencia/images/revista/67_2/PDF/Diabetes.pdf

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22770937

  Alteraciones en la Transcripción de Diabetes Gestacional

La Diabetes Gestacional es de herencia poligénica, es decir, que en su origen participan distintos genes de susceptibilidad, factores ambientales además de una falla en el funcionamiento y sobrevivencia de las células β. Se ha logrado identificar factores transcripciones que regulan la producción y secreción de insulina, y mantienen el fenotipo de la célula β.

Regiones cromosómicas contienen genes de susceptibilidad para la aparición de DG como el  gen  (HNF-1α), (HNF-4α), el gen del factor de transcripción (USF-1 factor) ,15 o el gen que codifica para el factor transcripcional TCF7L2.

El factor nuclear de hepatocitos 4 alfa (HNF-4α), es miembro de la superfamilia de factores de transcripción dependientes de ligando, es importante en el desarrollo, la diferenciación celular y el metabolismo del páncreas endocrino. Se presenta un ligamiento de la región cromosómica 20q12-13.1, donde se localiza el gen (HNF-4α), por lo que está asociado a diferentes polimorfismos de un solo nucleótido (SNP’s) de la región promotora y codificante de HNF-4.
El (SNP’s) de TCF7L2 es un marcador genético significativo en Diabetes Gestacional al influir en varias vías biológicas, los polimorfismos de TCF7L2 aumentan la susceptibilidad a DG al disminuir la producción de péptido -1 similar al glucagón (GLP-1).

Referencias: 

http://www.medigraphic.com/pdfs/sanmil/sm-2012/sm123c.pdf

https://www.nature.com/articles/srep30686

http://www.medigraphic.com/pdfs/revinvcli/nn-2009/nn095k.pdf

Alteraciones de la replicación en Diabetes del embarazo. 

Los cambios en la masa de las células beta se producen mediante replicación, hiperplasia, hipertrofia y neoformación en equilibrio con la apoptosis. FoxM1, un factor de transcripción que se expresa en las células en proceso de proliferación es un importante regulador de cambios de la masa de la célula beta y un regenerador de la misma, activa genes de síntesis de ADN, la disminución en la actividad de este factor resulta en una incapacidad de la célula para expandir su masa en situación en que aumenta la demanda metabólica de insulina y que más allá será requerido para la replicación de la célula beta inducida por efecto hormonal en el embarazo.

Se ha identificado variaciones genéticas fuera de la región codificante del gen HKDC1 (hexokinase domain containing 1) asociado a la tolerancia a la glucosa en mujeres embarazadas, como una nueva enzima con actividad hexokinasa, que fosforila la glucosa en el metabolismo materno.

Se han detectado también variantes en la secuencia de dos genes asociados a la susceptibilidad de la DG: TCF7L2 Y KCNQ1. Estas variantes genéticas asociadas son del tipo snp (Single Nucelotide Polymorphisms), esto es, cambios en un solo nucleótido del ADN. Se sabe que TCF7L2 codifica para una proteína que promueve la expresión de diversos genes que podrían estar involucrados con la fisiopatología de la DG. Por su parte, KCNQ1, en las células beta está implicado en el proceso de secreción de insulina.

Referencias bibliograficas: 

https://revistageneticamedica.com/2015/02/14/proteina-diabetes-gestacional/

https://www.amc.edu.mx/revistaciencia/images/revista/67_2/PDF/Diabetes.pdf

Enfermedad asignada: Diabetes del embarazo. 

La diabetes del embarazo o gestacional es la diabetes que aparece por primera vez cuando una mujer está embarazada. La mayoría de las veces esta diabetes desaparece una vez que nace el bebé, pero esto aumenta el riesgo de diabetes tipo 2 más adelante. El niño también presenta riesgo de obesidad y diabetes tipo 2.

Los niveles altos de azúcar en la sangre pueden causar daño al bebé en las primeras semanas del embarazo, cuando quizás la madre todavía no sabe que está embarazada. Para mantener al bebe y a la madre sanos es importante mantener el nivel de azúcar en la sangre tan cerca de lo normal posible como ocurría antes de quedar embarazada. 

 

Referencias bibliograficas: https://medlineplus.gov/spanish/diabetesandpregnancy.html